МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ - производство какого-либо продукта с помощью микроорганизмов. Осуществляемый микроорганизмами процесс называют ферментацией; емкость, в которой он протекает, называется ферментером (или биореактором). Процессы, протекающие при участии бактерий, дрожжей и плесневых грибов, человек применял сотни лет для получения пищевых продуктов и напитков, обработки текстиля и кожи, но участие в этих процессах микроорганизмов было четко показано только в середине 19 в. В 20 в. промышленность использовала все разнообразие замечательных биосинтетических способностей микроорганизмов, и теперь ферментация занимает центральное место в биотехнологии. С ее помощью получают разнообразные химикалии высокой степени чистоты и лекарственные препараты, изготавливают пиво, вино, ферментированные пищевые продукты. Во всех случаях процесс ферментации разделяется на шесть основных этапов.
Создание среды. Прежде всего необходимо выбрать соответствующую культуральную среду. Микроорганизмы для своего роста нуждаются в органических источниках углерода, подходящем источнике азота и различных минеральных веществах. При производстве алкогольных напитков в среде должны присутствовать осоложенный ячмень, выжимки из фруктов или ягод. Например, пиво обычно делают из солодового сусла, а вино - из виноградного сока. Помимо воды и, возможно, некоторых добавок эти экстракты и составляют ростовую среду. Среды для получения химических веществ и лекарственных препаратов намного сложнее. Чаще всего в качестве источника углерода используют сахара и другие углеводы, но нередко масла и жиры, а иногда углеводороды. Источником азота обычно служат аммиак и соли аммония, а также различные продукты растительного или животного происхождения: соевая мука, соевые бобы, мука из семян хлопчатника, мука из арахиса, побочные продукты производства кукурузного крахмала, отходы скотобоен, рыбная мука, дрожжевой экстракт. Составление и оптимизация ростовой среды являются весьма сложным процессом, а рецепты промышленных сред - ревниво оберегаемым секретом.
Стерилизация. Среду необходимо стерилизовать, чтобы уничтожить все загрязняющие микроорганизмы. Сам ферментер и вспомогательное оборудование тоже стерилизуют. Существует два способа стерилизации: прямая инжекция перегретого пара и нагревание с помощью теплообменника. Желаемая степень стерильности зависит от характера процесса ферментации. Она должна быть максимальной при получении лекарственных препаратов и химических веществ. Требования же к стерильности при производстве алкогольных напитков менее строгие. О таких процессах ферментации говорят как о "защищенных", поскольку условия, которые создаются в среде, таковы, что в них могут расти только определенные микроорганизмы. Например, при производстве пива ростовую среду просто кипятят, а не стерилизуют; ферментер также используют чистым, но не стерильным.
Получение культуры. Прежде чем начать процесс ферментации, необходимо получить чистую высокопродуктивную культуру. Чистые культуры микроорганизмов хранят в очень небольших объемах и в условиях, обеспечивающих ее жизнеспособность и продуктивность; обычно это достигается хранением при низкой температуре. Ферментер может вмещать несколько сотен тысяч литров культуральной среды, и процесс начинают, вводя в нее культуру (инокулят), составляющей 1-10% объема, в котором будет идти ферментация. Таким образом, исходную культуру следует поэтапно (с пересеваниями) растить до достижения уровня микробной биомассы, достаточного для протекания микробиологического процесса с требуемой продуктивностью. Совершенно необходимо все это время поддерживать чистоту культуры, не допуская ее заражения посторонними микроорганизмами. Сохранение асептических условий возможно лишь при тщательном микробиологическом и химико-технологическом контроле.
Рост в промышленном ферментере (биореакторе). Промышленные микроорганизмы должны расти в ферментере при оптимальных для образования требуемого продукта условиях. Эти условия строго контролируют, следя за тем, чтобы они обеспечивали рост микроорганизмов и синтез продукта. Конструкция ферментера должна позволять регулировать условия роста - постоянную температуру, pH (кислотность или щелочность) и концентрацию растворенного в среде кислорода. Обычный ферментер представляет собой закрытый цилиндрический резервуар, в котором механически перемешиваются среда и микроорганизмы. Через среду прокачивают воздух, иногда насыщенный кислородом. Температура регулируется с помощью воды или пара, пропускаемых по трубкам теплообменника. Такой ферментер с перемешиванием используется в тех случаях, когда ферментативный процесс требует много кислорода. Некоторые продукты, напротив, образуются в бескислородных условиях, и в этих случаях используются ферментеры другой конструкции. Так, пиво варят при очень низких концентрациях растворенного кислорода, и содержимое биореактора не аэрируется и не перемешивается. Некоторые пивовары до сих пор традиционно используют открытые емкости, но в большинстве случаев процесс идет в закрытых неаэрируемых цилиндрических емкостях, сужающихся книзу, что способствует оседанию дрожжей. В основе получения уксуса лежит окисление спирта до уксусной кислоты бактериями Acetobacter. Процесс ферментации протекает в емкостях, называемых ацетаторами, при интенсивной аэрации. Воздух и среда засасываются вращающейся мешалкой и поступают на стенки ферментера.
Выделение и очистка продуктов. По завершении ферментации в бульоне присутствуют микроорганизмы, неиспользованные питательные компоненты среды, различные продукты жизнедеятельности микроорганизмов и тот продукт, который желали получить в промышленном масштабе. Поэтому данный продукт очищают от других составляющих бульона. При получении алкогольных напитков (вина и пива) достаточно просто отделить дрожжи фильтрованием и довести до кондиции фильтрат. Однако индивидуальные химические вещества, получаемые путем ферментации, экстрагируют из сложного по составу бульона. Хотя промышленные микроорганизмы специально отбираются по своим генетическим свойствам так, чтобы выход желаемого продукта их метаболизма был максимален (в биологическом смысле), концентрация его все же мала по сравнению с той, которая достигается при производстве на основе химического синтеза. Поэтому приходится прибегать к сложным методам выделения - экстрагированию растворителем, хроматографии и ультрафильтрации. Переработка и ликвидация отходов ферментации. При любых промышленных микробиологических процессах образуются отходы: бульон (жидкость, оставшаяся после экстракции продукта производства); клетки использованных микроорганизмов; грязная вода, которой промывали установку; вода, применявшаяся для охлаждения; вода, содержащая в следовых количествах органические растворители, кислоты и щелочи. Жидкие отходы содержат много органических соединений; если их сбрасывать в реки, они будут стимулировать интенсивный рост естественной микробной флоры, что приведет к обеднению речных вод кислородом и созданию анаэробных условий. Поэтому отходы перед удалением подвергают биологической обработке, чтобы уменьшить содержание органического углерода.
ПРОМЫШЛЕННЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
Промышленные микробиологические процессы можно разбить на 5 основных групп: 1) выращивание микробной биомассы; 2) получение продуктов метаболизма микроорганизмов; 3) получение ферментов микробного происхождения; 4) получение рекомбинантных продуктов; 5) биотрансформация веществ.
Микробная биомасса. Микробные клетки сами по себе могут служить конечным продуктом производственного процесса. В промышленном масштабе получают два основных типа микроорганизмов: дрожжи, необходимые для хлебопечения, и одноклеточные микроорганизмы, используемые как источник белков, которые можно добавлять в пищу человека и животных. Пекарские дрожжи выращивали в больших количествах с начала 20 в. и использовали в качестве пищевого продукта в Германии во время Первой мировой войны. Однако технология производства микробной биомассы как источника пищевых белков была разработана только в начале 1960-х годов. Ряд европейских компаний обратили внимание на возможность выращивания микробов на таком субстрате, как углеводороды, для получения т.н. белка одноклеточных организмов (БОО). Технологическим триумфом было получение продукта, добавляемого в корм скоту и состоящего из высушенной микробной биомассы, выросшей на метаноле. Процесс шел в непрерывном режиме в ферментере с рабочим объемом 1,5 млн. л. Однако в связи с ростом цен на нефть и продукты ее переработки этот проект стал экономически невыгодным, уступив место производству соевой и рыбной муки. К концу 80-х годов заводы по получению БОО были демонтированы, что положило конец бурному, но короткому периоду развития этой отрасли микробиологической промышленности. Более перспективным оказался другой процесс - получение грибной биомассы и грибного белка микопротеина с использованием в качестве субстрата углеводов.
Продукты метаболизма. После внесения культуры в питательную среду наблюдается лаг-фаза, когда видимого роста микроорганизмов не происходит; этот период можно рассматривать как время адаптации. Затем скорость роста постепенно увеличивается, достигая постоянной, максимальной для данных условий величины; такой период максимального роста называется экспоненциальной, или логарифмической, фазой. Постепенно рост замедляется, и наступает т.н. стационарная фаза. Далее число жизнеспособных клеток уменьшается, и рост останавливается. Следуя описанной выше кинетике, можно проследить за образованием метаболитов на разных этапах. В логарифмической фазе образуются продукты, жизненно важные для роста микроорганизмов: аминокислоты, нуклеотиды, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и т.д. Их называют первичными метаболитами. Многие первичные метаболиты представляют значительную ценность. Так, глутаминовая кислота (точнее, ее натриевая соль) входит в состав многих пищевых продуктов; лизин используется как пищевая добавка; фенилаланин является предшественником заменителя сахара аспартама. Первичные метаболиты синтезируются природными микроорганизмами в количествах, необходимых лишь для удовлетворения их потребностей. Поэтому задача промышленных микробиологов состоит в создании мутантных форм микроорганизмов - сверхпродуцентов соответствующих веществ. В этой области достигнуты значительные успехи: например, удалось получить микроорганизмы, которые синтезируют аминокислоты вплоть до концентрации 100 г/л (для сравнения - организмы дикого типа накапливают аминокислоты в количествах, исчисляемых миллиграммами). В фазе замедления роста и в стационарной фазе некоторые микроорганизмы синтезируют вещества, не образующиеся в логарифмической фазе и не играющие явной роли в метаболизме. Эти вещества называют вторичными метаболитами. Их синтезируют не все микроорганизмы, а в основном нитчатые бактерии, грибы и спорообразующие бактерии. Таким образом, продуценты первичных и вторичных метаболитов относятся к разным таксономическим группам. Если вопрос о физиологической роли вторичных метаболитов в клетках-продуцентах был предметом серьезных дискуссий, то их промышленное получение представляет несомненный интерес, так как эти метаболиты являются биологически активными веществами: одни из них обладают антимикробной активностью, другие являются специфическими ингибиторами ферментов, третьи - ростовыми факторами, многие обладают фармакологической активностью. Получение такого рода веществ послужило основой для создания целого ряда отраслей микробиологической промышленности. Первым в этом ряду стало производство пенициллина; микробиологический способ получения пенициллина был разработан в 1940-х годах и заложил фундамент современной промышленной биотехнологии. Фармацевтическая промышленность разработала сверхсложные методы скрининга (массовой проверки) микроорганизмов на способность продуцировать ценные вторичные метаболиты. Вначале целью скрининга было получение новых антибиотиков, но вскоре обнаружилось, что микроорганизмы синтезируют и другие фармакологически активные вещества. В течение 1980-х годов было налажено производство четырех очень важных вторичных метаболитов. Это были: циклоспорин - иммунодепрессант, используемый в качестве средства, предотвращающего отторжение имплантированных органов; имипенем (одна из модификаций карбапенема) - вещество с самым широким спектром антимикробного действия из всех известных антибиотиков; ловастатин - препарат, снижающий уровень холестерина в крови; ивермектин - антигельминтное средство, используемое в медицине для лечения онхоцеркоза, или "речной слепоты", а также в ветеринарии. Ферменты микробного происхождения. В промышленных масштабах ферменты получают из растений, животных и микроорганизмов. Использование последних имеет то преимущество, что позволяет производить ферменты в огромных количествах с помощью стандартных методик ферментации. Кроме того, повысить продуктивность микроорганизмов несравненно легче, чем растений или животных, а применение технологии рекомбинантных ДНК позволяет синтезировать животные ферменты в клетках микроорганизмов. Ферменты, полученные таким путем, используются главным образом в пищевой промышленности и смежных областях. Синтез ферментов в клетках контролируется генетически, и поэтому имеющиеся промышленные микроорганизмы-продуценты были получены в результате направленного изменения генетики микроорганизмов дикого типа.
Рекомбинантные продукты. Технология рекомбинантных ДНК, более известная под названием "генная инженерия", позволяет включать гены высших организмов в геном бактерий. В результате бактерии приобретают способность синтезировать "чужеродные" (рекомбинантные) продукты - соединения, которые прежде могли синтезировать только высшие организмы. На этой основе было создано множество новых биотехнологических процессов для производства человеческих или животных белков, ранее недоступных или применявшихся с большим риском для здоровья. Сам термин "биотехнология" получил распространение в 1970-х годах в связи с разработкой способов производства рекомбинантных продуктов. Однако это понятие гораздо шире и включает любой промышленный метод, основанный на использовании живых организмов и биологических процессов. Первым рекомбинантным белком, полученным в промышленных масштабах, был человеческий гормон роста. Для лечения гемофилии используют один из белков системы свертывания крови, а именно фактор VIII. До того как были разработаны методы получения этого белка с помощью генной инженерии, его выделяли из крови человека; применение такого препарата было сопряжено с риском заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Долгое время сахарный диабет успешно лечили с помощью инсулина животных. Однако ученые полагали, что рекомбинантный продукт будет создавать меньше иммунологических проблем, если его удастся получать в чистом виде, без примесей других пептидов, вырабатываемых поджелудочной железой. Кроме того, ожидалось, что число больных диабетом будет со временем увеличиваться в связи с такими факторами, как изменения в характере питания, улучшение медицинской помощи беременным, страдающим диабетом (и как следствие - повышение частоты генетической предрасположенности к диабету), и, наконец, ожидаемое увеличение продолжительности жизни больных диабетом. Первый рекомбинантный инсулин поступил в продажу в 1982, а к концу 1980-х годов он практически вытеснил инсулин животных.
Многие другие белки синтезируются в организме
человека в очень небольших количествах, и единственный способ получать их в масштабах, достаточных для использования в клинике, - технология рекомбинантных ДНК. К таким белкам относятся интерферон и эритропоэтин. Эритропоэтин совместно с миелоидным колониестимулирующим фактором регулирует процесс образования клеток крови у человека. Эритропоэтин используется для лечения анемии, связанной с почечной недостаточностью, и может найти применение как средство, способствующее повышению уровня тромбоцитов, при химиотерапии раковых заболеваний.
Биотрансформация веществ. Микроорганизмы можно использовать для превращения тех или иных соединений в структурно сходные, но более ценные вещества. Поскольку микроорганизмы могут проявлять свое каталитическое действие в отношении лишь каких-то определенных веществ, протекающие при их участии процессы более специфичны, чем чисто химические. Наиболее известный процесс биотрансформации - получение уксуса в результате превращения этанола в уксусную кислоту. Но среди продуктов, образующихся при биотрансформации, есть и такие высокоценные соединения, как стероидные гормоны, антибиотики, простагландины. См. также ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ.
ЛИТЕРАТУРА
Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии (специальный выпуск журнала "Scientific American"). М., 1984 Биотехнология. Принципы и применение. М., 1988